Biologisk speciale

Dette en specialerapport fra Aarhus Universitet, Biologisk Institut, Afdeling for Mikrobiel Økologi, Marts 1999.
Specialerapporten har titlen: "Cellulosenedbrydende bakterier i jord  -Karakterisering af cellulaseaktivitet hos Cytophaga hutchinsonii."
Forfatter: Annemette S. Sørensen.
Rapporten beror på 2 års arbejde med renkulturer af den cellulytiske jordbakterie Cytophaga hutchinsonii, hvor hovedformålet var karakterisering af cellulaseaktiviteterne. Karakterisering af cellulaseaktiviteterne hos C. hutchinsonii er ikke tidligere rapporteret.
 

Resume

Et naturligt agarmedie baseret på jordekstrakt samt en fosfatbuffer, med cellulose som eneste kulstof- og energikilde, kan anvendes til at detektere en cellulytisk bakterie som Cellulomonas uda. Cytophaga hutchinsonii kan ikke vokse på denne simple udformning af mediet, men den vokser på CY-agar, et defineret medie, tilsat et cellulosesubstrat samt lave koncentrationer af cellobiose eller glucose.
Cellulytisk aktivitet ses direkte som klaringszoner på agarplader, men hydrolyse af krystallinske cellulosesubstrater kan dog først erkendes efter flere ugers inkubationstid.
Defineret flydende MSM-medie tilsat uopløselige farvede substrater, RBB-Cellofan eller RBB-Avicel, kan anvendes til at detektere cellulaseaktivitet hos en bakterietype som C. hutchinsonii.
Substituerede cellulosesubstrater, CMC og HECellulose, kan hydrolyseres af C. hutchinsonii selvom cellerne ikke kan vokse på substraterne, antageligt fordi de substituerede grupper inhiberer enzymerne så der ikke dannes metaboliserbare produkter. Desuden hydrolyserer bakterien xylan, men den kan ikke vokse på xylan eller xylose; måske er cellerne, i nogle tilfælde, i deres naturlige omgivelser afhængige af, at kunne hydrolysere xylan for at få adgang til cellulose.

Exocellulaseaktivitet hos Cytophaga hutchinsonii kan ikke måles tilfredsstillende vha. assays, som måler produktion af reducerende sukre. Reagenserne interfererer med substraterne eller der er manglende respons og cellobiose påvirker farveudviklingen i assays meget sammenlignet med ens molære koncentrationer af glucose.
Måling af exocellulaseaktivitet som farvefrigivelse fra RBB-Avicel er et bedre assay til at måle exocellulaseaktivitet hos C. hutchinsonii. Avicelaseaktiviteten må være tilknyttet cellerne, da kultursupernatant tilsyneladende ikke kan hydrolysere substratet. Enzymerne eller deres aktive sites, er sandsynligvis lokaliseret på celleoverfladen. Hydrolyseaktiviteten hæmmes når cellerne er døde efter behandling med azid.
Exocellulaseaktiviteten generelt, er meget langsom med en bakterietype som Cytophaga hutchinsonii.

Måling af endocellulaseaktivitet som produktion af reducerende sukre viser, at supernatant fra Cytophaga hutchinsonii indeholder endocellulaser, der hydrolyserer CMC, men en del af denne aktivitet stammer fra celleassocierede enzymer.
Farvefrigivelse fra AZCL-HECellulose som substrat, er et meget bekvemt og tilstrækkeligt følsomt assay til bestemmelse af endocellulaseaktivitet hos C. hutchinsonii. HEcellulaseaktiviteten er konstitutiv og C. hutchinsonii udskiller endocellulaser under vækst på glucose, hvor den extracellulære hydrolyseaktivitet i slutningen af den eksponentielle vækstfase udgør 33% af den samlede hydrolyseaktivitet. Ekskretion af cellulaser er ikke tidligere rapporteret for denne bakterie. Den relative HEcellulaseaktivitet hos supernatanten og kulturvæsken er i mange tilfælde sammenfaldende og derfor er der sandsynligvis tale om den/de samme cellulase(r).
Tilsætning af detergent, Triton X-100, før nedfrysning, stimulerer hydrolyseaktiviteten i kulturvæsken. Vækst i batch kulturer med enten krystallinske eller ikke-krystallinske kulstofkilder betyder ikke større forskelle i hydrolyseaktivitet.
Cellulaserne er kun temperaturstabile ved 20 °C og deres temperaturoptimum er 40 °C.
HEcellulaserne er pH tolerante og de er meget halotolerante.
Cellulaserne hæmmes af forhøjede koncentrationer af cellobiose og glucose under assay, og forhøjede niveauer af glucose i vækstmediet medfører catabolit repression.